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SiRNA實驗

時間:2017-01-20 作者:市場部 文章來源: 瀏覽:1278

RNA干擾整體實驗服務—SiRNA實驗

第二部分:細胞培養、轉染以及siRNA的篩選
一、細胞培養
使用10%胎牛 DMEM培養液,37℃下置于5%CO2培養箱中。待細胞融合至80%,用0.25%胰酶消化傳代后接種(細胞密度5 XlO4)于培養瓶或孔板,待細胞融合至約70%后用于實驗。以下圖片均用顯微鏡100X拍照

YYYY細胞圖片如下:


RNA干擾整體實驗服務, RNAi基因干擾, SiRNA實驗, RNAi



1)細胞培養方法:略
二、細胞轉染
材料:YYYY細胞;XXXX基因siRNA(20Μm, 合成);Lipofectamine 2000試劑(使用前貯存在+4℃);Opti-MEM I 低血清培養基(使用前37℃預熱);6孔組織培養板
轉染步驟:使用Lipofectamine 2000轉染siRNA。轉染前一天,4-5×104細胞接種在6孔板上,2mL含FBS的基礎培養基;選擇用于初期接種的細胞數量,應能在24小時內使細胞匯合達到70%;按照如下的方法準備siRNA- Lipofectamine 2000復合物:a.以250ul Opti-MEM I稀釋5ul Lipofectamine 2000,輕輕混勻,室溫下孵育5分鐘。b.以250ulOpti-MEM I稀釋250pmol siRNA,輕輕混勻。c.孵育5分鐘后,混合稀釋的siRNA和稀釋的Lipofectamine 2000,輕輕混合,在室溫下孵育20分鐘,以便允許復合物的形成。溶液可能出現混濁,但是這不會影響轉染;將siRNA - Lipofectamine 2000復合物加入到每一個包含細胞和培養基的孔中。通過輕輕地前后搖動培養板混合;6小時后進行FAM-siRNA熒光檢測轉染率;37℃,CO2培養箱孵育48小時,進行WB,real-time檢測。
轉染效率檢測:


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熒光鏡下視野                                                   光鏡下視野


通過熒光鏡下視野與光鏡下視野對比可知,細胞的轉染效率達到70%以上可以進行后續的WB real-time檢測。



三、siRNA最佳濃度篩選
實驗分組:A 正常組;B 陰性對照組;C XXXX-1轉染組;D XXXX-2轉染組;E XXXX-3轉染組
第一個篩選實驗:熒光定量PCR實驗
實驗分組:


NO

樣本編號

1

A

2

B

3

C

4

D

5

E


實驗試劑:Trizol, Invitrogen ,#15596-026;RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas #K1631;Deoxyribonuclease I (DNase I), Fermentas #EN0521;RiboLock? Ribonuclease Inhibitor, Fermentas #EO0381;SYBR GreenPCR Master Mix,ABI 4309155;Realtime-PCR儀,ABI 7900型;引物由primer3.0軟件設計,并由艾柏森生物合成。步驟(略)。
結果數據:Ct(基本循環數);ΔCt(基本循環與內參循環數差值);ΔΔCt*(最低樣本ΔCt值—其它各樣本ΔCt值);2-ΔΔCt(RQ) :目的基因mRNA相對含量(* 相對定量以含量最低的樣本為標準,其余各樣本的含量均為相對該樣本的倍數.具體方法參見Kenneth,et al. (2001) METHODS 25, 402–408)。
擴增曲線:在實時熒光PCR擴增反應中,熒光擴增曲線主要分為4個特征性階段:基線期,指數期初期,指數期,平臺期,在軟件中顯示形狀是一條平滑的S型曲線。目的基因的擴增曲線符合4個特征性階段的平滑的S型曲線,陰性對照(模板為水)無顯著熒光信號,提示熒光定量PCR反應程序正常運行,目的基因得到有效擴增,實驗操作規范,試劑符合實驗要求。
熔點曲線:從軟件中顯示形狀只有一個峰值,沒有出現雜峰,提示無非特異性熒光信號,目的基因擴增產物單一,有利于結果分析。


RNA干擾整體實驗服務, RNAi基因干擾, SiRNA實驗, RNAi


Sample

CT

ΔCт

ΔΔCт

RQ

RQ mean

SD

1

26.1312

5.7691

-2.2238

4.6712

4.4587

0.6585

1

26.3320

6.0975

-1.8954

3.7203



1

26.0145

5.6754

-2.3175

4.9847



2

27.0101

5.9786

-2.0143

4.0398

3.9841

0.0485

2

27.0077

6.0073

-1.9856

3.9603



2

27.0584

6.0103

-1.9826

3.9520



3

28.1032

8.3378

0.3449

0.7874

0.5186

0.2327

3

28.7212

9.3670

1.3741

0.3858



3

28.5034

9.3785

1.3856

0.3827



4

28.0210

7.8063

-0.1866

1.1381

1.3224

0.2119

4

28.0042

7.6421

-0.3508

1.2753



4

27.9142

7.3570

-0.6359

1.5539



5

26.3742

7.0578

-0.9351

1.9120

2.1770

0.3723

5

26.5004

6.6129

-1.3800

2.6027



5

26.6316

6.9812

-1.0117

2.0163



1-內參

20.3621


1-內參

20.2345


1-內參

20.3391


2-內參

21.0315


2-內參

21.0004


2-內參

21.0481


3-內參

19.7654


3-內參

19.3542


3-內參

19.1249


4-內參

20.2147


4-內參

20.3621


4-內參

20.5572


5-內參

19.3164


5-內參

19.8875


5-內參

19.6504



第二個篩選實驗:WB實驗
實驗試劑:略
WB實驗操作流程:略

實驗結果:陽性條帶以Gel pro4.0 版凝膠光密度分析軟件進行分析,測其IOD(integrated optical density)累積光密度參考值。


RNA干擾整體實驗服務, RNAi基因干擾, SiRNA實驗, RNAi



Lanes:

Lane  1

Lane  2

Lane  3

Lane  4

Lane  5

Rows

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

XXXX

216.21

200.86

60.691

124.52

166.52

GAPDH

299.62

295.32

293.13

307.85

312.45

樣本

A

B

C

D

E


以上實驗得出XXXX-1干預效果最好,可選擇做后續實驗。

第三部分:細胞增殖、細胞黏附功能、細胞侵襲、細胞遷移實驗
實驗分組:A  正常細胞培養組;B  XXXX-1干預組

一、MTT方法檢測細胞毒性
原理:MTT分析法以代謝還原噻唑藍3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)為基礎?;釹赴南吡L逯寫嬖謨隢ADP相關的脫氫酶,可將黃色的MTT還原為不溶性的藍紫色的甲月贊(Formazan),死細胞此酶消失,MTT不被還原。 用DMSO溶解Formazan后可用酶標儀在570nm(450nm)波長處檢測光密度。
操作步驟:在96孔板加入細胞100μL/孔(約1×104),置37℃ 5%CO2細胞培養箱培養24小時;加入適當濃度的受試化合物;將96孔板在37℃,含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養箱中孵育適當時間;將5×MTT用 DilutionBuffer稀釋成1× MTT;每孔加50μL 1× MTT,在37℃孵育4小時,使MTT還原為甲月贊;吸出上清液,每孔加150μL DMSO使甲月贊溶解,用平板搖床搖勻;酶標儀在570nm波長處檢測每孔的光密度。
結果分析:細胞存活率% =(加藥細胞OD-本地OD/對照細胞OD-本地OD)×100%。注:本底OD值(完全培養基加MTT,無細胞)


0h 570nm波長各孔OD值:

實驗分組

樣品

平行樣品

平行樣品

平均值

A

0.457

0.452

0.463

0.457

B

0.461

0.448

0.454

0.454

本底

0.007

0.009

0.010

0.009


12h 570nm波長各孔OD值:

實驗分組

樣品

平行樣品

平行樣品

平均值

A

0.503

0.518

0.511

0.511

B

0.494

0.501

0.489

0.495

本底

0.009

0.012

0.011

0.011


24h 570nm波長各孔OD值:

實驗分組

樣品

平行樣品

平行樣品

平均值

A

0.618

0.607

0.624

0.616

B

0.573

0.566

0.584

0.574

本底

0.007

0.008

0.008

0.008


48h 570nm波長各孔OD值:

實驗分組

樣品

平行樣品

平行樣品

平均值

A

0.744

0.765

0.738

0.749

B

0.636

0.663

0.657

0.652

本底

0.009

0.008

0.008

0.008


72h 570nm波長各孔OD值:


實驗分組

樣品

平行樣品

平行樣品

平均值

A

0.821

0.817

0.834

0.824

B

0.701

0.724

0.695

0.707

本底

0.013

0.008

0.009

0.010


RNA干擾整體實驗服務, RNAi基因干擾, SiRNA實驗, RNAi



二、細胞粘附能力實驗
試劑耗材及儀器設備:結晶紫染色液;1×PBS, 實驗室常備,配方參照《分子克隆實驗指南 第二版》;儀器:美國bio-rad公司酶標儀 #680
操作步驟:采用結晶紫染色法測定。將Fn和Ln用1×PBS液分別稀釋成100μg/ml和200μg/ml,以每孔100μl分別包被96孔板;37℃包被2h,用1×PBS洗滌2次,再用1% BSA封閉2h。;將各組細胞按常規方法收集后用無血清培養基制成單細胞懸液,每個樣本計數3次取平均數,調節細胞濃度為3×105個/ml,以每孔200μl加入包被好的培養板中,置37℃,5%CO2培養箱中孵育2h;取出96孔板,輕輕洗去未粘附的細胞,每孔用100μl 4%中性甲醛固定,30分鐘后洗去;每孔加100μl 0.5%結晶紫,室溫染色2h,,蒸餾水洗滌一次,陰干后每孔加入100μl 2% SDS溶液,放置酶標儀中570nm波長測定各孔OD值。
檢測結果:

0h  570nm波長各孔OD值:
Ln OD值

分組

樣品

平行樣品

平行樣品

平均值

A

0.586

0.563

0.592

0.580

B

0.575

0.580

0.577

0.577


Fn OD值

分組

樣品

平行樣品

平行樣品

平均值

A

0.649

0.633

0.654

0.645

B

0.627

0.641

0.638

0.635


12h  570nm波長各孔OD值:
Ln OD值

分組

樣品

平行樣品

平行樣品

平均值

A

0.594

0.584

0.571

0.583

B

0.546

0.543

0.558

0.549


Fn OD值

分組

樣品

平行樣品

平行樣品

平均值

A

0.656

0.639

0.643

0.646

B

0.609

0.611

0.603

0.608


24h  570nm波長各孔OD值:
Ln OD值

分組

樣品

平行樣品

平行樣品

平均值

A

0.602

0.591

0.603

0.599

B

0.511

0.508

0.502

0.507


Fn OD值

分組

樣品

平行樣品

平行樣品

平均值

A

0.671

0.665

0.653

0.663

B

0.563

0.574

0.585

0.574


48h  570nm波長各孔OD值:
Ln OD值

分組

樣品

平行樣品

平行樣品

平均值

A

0.575

0.582

0.586

0.581

B

0.474

0.463

0.481

0.473


Fn OD值

分組

樣品

平行樣品

平行樣品

平均值

A

0.648

0.659

0.661

0.656

B

0.521

0.516

0.534

0.524


72h  570nm波長各孔OD值:
Ln OD值

分組

樣品

平行樣品

平行樣品

平均值

A

0.569

0.573

0.568

0.570

B

0.392

0.407

0.384

0.394


Fn OD值

分組

樣品

平行樣品

平行樣品

平均值

A

0.636

0.641

0.652

0.643

B

0.489

0.476

0.486

0.484


三、細胞侵襲實驗
實驗材料:Corning公司:Transwell6孔板,孔徑8um. BD公司:基底膜Matrigel
Transwell小室制備:在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80μl,置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝膠。
制備細胞懸液:消化細胞,終止消化后離心棄去培養液,用PBS洗1-2遍,用含BSA的無血清培養基重懸。調整細胞密度至5×104/ml。
接種細胞:6孔板下室加入1ml含FBS的培養基。上室加入細胞懸液,培養細胞。
結果統計:用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞;用95%酒精固定15-20min;HE染色10分鐘;

細胞計數:取5個視野于倒置顯微鏡觀察照相(放大倍數400)
A  

RNA干擾整體實驗服務, RNAi基因干擾, SiRNA實驗, RNAi

平均107個細胞



B  
RNA干擾整體實驗服務, RNAi基因干擾, SiRNA實驗, RNAi

平均66個細胞


RNA干擾整體實驗服務, RNAi基因干擾, SiRNA實驗, RNAi

平均98個細胞


B  
RNA干擾整體實驗服務, RNAi基因干擾, SiRNA實驗, RNAi

平均54個細胞


A  
RNA干擾整體實驗服務, RNAi基因干擾, SiRNA實驗, RNAi

平均103個細胞


B  
RNA干擾整體實驗服務, RNAi基因干擾, SiRNA實驗, RNAi

平均61個細胞


四、細胞遷移實驗
材料:Corning公司:Transwell6孔板,孔徑8um.
制備細胞懸液:消化細胞,終止消化后離心棄去培養液,用PBS洗1-2遍,用含BSA的無血清培養基重懸。調整細胞密度至5×104/ml。
接種細胞:6孔板下室加入1ml含FBS的培養基;取細胞懸2ml加入Transwell小室;培養細胞:常規培養24h。
結果統計:用棉簽擦去上室內的細胞;用95%酒精固定15-20min;HE染色10分鐘;細胞計數:取5個視野于倒置顯微鏡觀察照相(放大倍數400)
A  

RNA干擾整體實驗服務, RNAi基因干擾, SiRNA實驗, RNAi

平均119個細胞


B

RNA干擾整體實驗服務, RNAi基因干擾, SiRNA實驗, RNAi

平均54個細胞


A   
RNA干擾整體實驗服務, RNAi基因干擾, SiRNA實驗, RNAi

平均115個細胞


RNA干擾整體實驗服務, RNAi基因干擾, SiRNA實驗, RNAi

平均52個細胞


A  
RNA干擾整體實驗服務, RNAi基因干擾, SiRNA實驗, RNAi

平均121個細胞


B  

RNA干擾整體實驗服務, RNAi基因干擾, SiRNA實驗, RNAi